استخراج و خالص سازی آنزیم اوره آز از منابع گیاهی

آنزیم اوره آز از دسته آنزیمهای هیدرولاز می باشد که هیدرولیز اوره (سوبسترای اصلی) را کاتالیز کرده و باعث آزادسازی آمونیاک و co2 می گردد. این آنزیم که در کیت های آزمایشگاهی برای اندازه گیری اروه در سرم کاربرد فراوان دارد یکی از پروتئینهای موجود در دانه لگومینوزها (نخودیان) می باشد. جهت یافتن منبع مناسب برای تولید این آنزیم دانه های متعددی مورد بررسی قرار گرفتند که عبارت بودنداز: لوبیا چشم بلبلی، لوبیا چیتی، لوبیا سفید، لوبیا قرمز، لوبیا رشتی، لوبیا سبز، باقلا سبز، باقلا زرد، باقلا تازه، سویا تازه و سویا خشک ، که از میان آنها دانه روغنی سویا حاوی بیشترین مقدار آنزیم بود و بنابراین جهت مطالعه مناسب تشخیص داده شد. برای استخراج آنزیم از دانه سویا، پس از خرد و پودر کردن دانه رسیده، پودر در بافر فسفات 0/1 مولار، ph7/6 (حاوی edta 30 mm و 10mm مرکاپتواتانول) به مدت 4 ساعت در یخچال همزده شد و مدت یک شب در همان محیط نگهداری گردید. سپس رسوبات با سانتریفیوژ جدا شده و از محلول رویی جهت سنجش مقدار فعالیت آنزیم و پروتئین موجود استفاده گردید. پس از استخراج آنزیم دانه، برای جداسازی پروتئینها، روشهای متعددی از جمله رسوب باحلالهای آلی مانند استن، اتانول، ایزوپروپانول و متانول در حجم های مختلف استفاده شد ولی بدلیل غیرطبیعی کردن پروتئین و غیرفعال شدن آنزیم و در نتیجه کم بودن میزان بازدهی هیچ یک مناسب تشخیص داده نشد و از آنها استفاده نگردید. برای خالص سازی آنزیم ابتدا از ستون سفاکریل s-200 استفاده شد و یک پیک پروتئنی بدست آمد که فعالیت بسیار خوب اوره آزی داشت .این پیک برای خالص سازی بیشتر روی ستون deae - sepharose برده شد و دو پیک فعالیت نشان داد. برای تعیین خلوص پیکها از روش اکتروفورز page استفاده گردید. نتایج حاصل از رنگ آمیزی باکوماسی بلو و تعیین فعالیت ، نشان داد که دو باند پروتئینی ظاهر شده در رنگ آمیزی کوماسی بلو با دو باند فعالیت کاملا انطباق دارند و این مسئله در مورد آنزیم استاندارد نیز صادق است . ph بهینه برای آنزیم اوره آز سویا و آنزیم استاندارد حاصل از jack bean، 7 می باشد. با افزایش مولاریته بافر بکاررفته، فعالیت آنزیم کاهش می یابد. بهترین دما برای فعالیت آنزیم سویا 45 سانتی گراد و برای آنزیم استاندارد 40 سانتی گراد می باشد. پایداری آنزیم در دماهای 25 سانتی گراد الی 42 سانتی گراد تا 48 ساعت نسبتا خوب بوده و پس از کاهش اندکی در چند ساعت اول، در حدود 70-80 درصد ثابت می ماند. در دماهای بالاتر پایداری کمتر می باشد. در دماهای 60 و 65 سانتی گراد این کاهش چشمگیر بوده و فعالیت آنزیم در 6 ساعت به 30 درصد می رسد. بررسی تاثیر یونهای فلزzn2+, mn2+, cu2+, ni+, co2+ و ag+ بر فعالیت آنزیم نشان داد که تمامی آنها اثر بازدارندگی بر فعالیت آنزیم دارند، که در این میان اثر بازدارندگی cu2+ و zn2+ بیش از سایر یونها می باشد. با استفاده از نمودار میکالیس - منتون، مقادیر km و vmax آنزیم به ترتیب 3/417×103 ?mol و 68/9 ?mol/min بدست آمد.